由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引发的小麦条锈病是一种极具危害性的气传性真菌病害，通常会造成5%—30%的产量损失，严重时甚至绝收，对小麦安全生产构成重大威胁。种植抗病品种是防治该病害最经济有效的途径之一。条锈菌为活体营养专性寄生真菌，通过吸器向小麦细胞分泌效应蛋白，操纵植物免疫促进侵染。阻止病原菌对寄主的操纵，是创制抗病材料的切实可行途径。深入解析小麦与条锈菌互作机制，挖掘病菌致病关键基因和小麦免疫调控因子，可为小麦抗病遗传改良提供可利用基因与理论依据。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应通过将植物细胞外的信号转导至细胞内，在植物先天免疫中发挥着关键作用，但在植物中仅有少数完整的MAPK级联反应被证实能够赋予对病原菌的抗性。鉴于MAPK级联反应在植物免疫中的重要作用，病原菌进化出了多种效应蛋白，靶向MAPK级联反应，从而操控宿主的免疫反应并促进自身的侵染。
近日，JIPB在线发表了西北农林科技大学作物抗逆与高效生产全国重点实验室/植物保护学院植物免疫团队题为“Wheat MAPK cascade mediates SGT1 nuclear entry targeted by a stripe rust effector”（全文链接https://doi.org/10.1111/jipb.13888）的研究。该研究鉴定出了一个有助于小麦抗条锈病的TaMKK2-TaMAPK6-TaSGT1信号级联反应，发现小麦条锈菌效应蛋白HASP215能够靶向TaMKK2互作，破坏TaMKK2-TaMAPK6-TaSGT1磷酸化级联反应，抑制寄主免疫，促进条锈菌侵染致病。
本研究鉴定到了一个小麦丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶（TaMKK2），利用基因敲除突变体和过表达转基因小麦，证明了TaMKK2是小麦抗条锈病的重要正调控因子。TaMKK2能够与TaMAPK6相互作用并使其磷酸化，而TaMAPK6能够磷酸化核心免疫调节因子TaSGT1（Skp1的G2等位基因抑制子），从而增强TaSGT1进入细胞核，赋予小麦对条锈病的抗性。为对抗小麦的防御，小麦条锈菌通过其特化侵染结构吸器向寄主细胞分泌毒性效应蛋白HASP215。HASP215靶向TaMKK2，通过干扰TaMKK2-TaMAPK6互作抑制TaMAPK6的磷酸化，致使TaMAPK6介导的TaSGT1磷酸化及细胞核转运受抑，最终导致小麦免疫被削弱。综上，该研究阐明了TaMKK2-TaMAPK6级联反应通过调节关键免疫成分TaSGT1正调控小麦抗病性，而HASP215作为锈菌关键效应蛋白直接抑制这一信号级联反应的小麦—条锈菌攻防机制。
攻击植物MAPK或SGT1已被病原体效应蛋白广泛采用。与之不同的是，该研究表明，一种锈菌效应蛋白靶向小麦免疫信号转导中的TaMKK2-TaMAPK6-TaSGT1模块，为深入理解MAPK级联反应在作物免疫中的作用，及专性活体营养型真菌的致病机制提供了新的见解，有助于更全面地理解植物免疫系统以及条锈菌的侵染途径。基于此，我们构建了稳定的Hasp215 RNA干扰和TaMKK2、TaSGT1过表达转基因植株，显著提高了小麦对条锈病的抗性，为培育小麦抗病新材料提供了基因资源。
西北农林科技大学已毕业博士舒伟学为论文第一作者，王晓杰教授和汤春蕾研究员为通讯作者，康振生教授参与并指导了该研究。研究得到了国家自然科学基金项目（32225041, 32272511）、农业生物育种国家科技重大专项（2023ZD04070）等项目资助。
1.HASP215 是 Pst重要毒性效应蛋白
我们利用农杆菌介导的小麦遗传转化体系创制了稳定过表达HASP215的小麦转基因材料。接种CYR23后，HASP215-OE植株在产生过敏性坏死反应的同时产生少量的夏孢子堆；条锈菌侵染点周围活性氧产生面积减少，TaPR1和TaPR2表达下降，条锈菌菌丝长度与侵染面积均增加，生物量升高，表明在小麦中过表达HASP215抑制条锈菌激发的免疫反应，促进条锈菌侵染。HASP215-RNAi小麦接种CYR32，条锈菌产孢量明显减少，条锈菌菌丝长度和菌丝面积减小，生物量降低，细胞坏死面积增加，TaPR1和TaPR2表达升高，表明沉默HASP215增强了小麦对条锈菌抗性，抑制了条锈菌的致病力。结果表明，HASP215为显著影响条锈菌致病性的重要效应蛋白。
2. HASP215靶向小麦抗性正调控因子TaMKK2
利用免疫共沉淀与质谱技术筛选HASP215的候选靶标，并利用酵母双杂交实验,荧火素酶互补实验和免疫共沉淀实验表明HASP215与小麦TaMKK2互作。利用RISPR-Cas9编辑技术创制了TaMKK2-KO突变体转基因材料，接种CYR23后，TaMKK2-KO叶片上产生少量夏孢子，菌丝长度和侵染面积增加。转基因TaMKK2-OE小麦材料接种CYR32，植株叶片条锈菌产孢量显著减少，条锈菌的生长发育受到抑制，小麦MAPK磷酸化水平增加，活性氧面积增加，TaPR1、TaPR2和TaWRKY53表达上调。在TaMKK2-OE小麦中瞬时表达HASP215则抑制MAPK磷酸化水平，降低防御相关基因表达，削弱TaMKK2-OE抗病性。结果表明TaMKK2正调控小麦对条锈菌的抗性，效应子HASP215抑制TaMKK2对条锈菌的抗性。
3. HASP215抑制TaMKK2与TaMAPK6的互作
利用IP-MS筛选TaMKK2的互作靶标，并通过萤光素酶互补实验和Co-IP实验表明TaMKK2与TaMAPK4/6互作。TaMKK2能磷酸化TaMAPK4/6，而HASP215能够抑制TaMKK2对TaMAPK4/6的磷酸化，且随着HASP215蛋白量增加TaMAPK4/6磷酸化条带减弱。ITC实验表明HASP215与TaMKK2的结合亲和力高于TaMKK2与TaMAPK4/6的结合亲和力，且Pull-down实验表明随着HASP215蛋白量的增加TaMKK2与TaMAPK4/6互作减少。
4. TaMAPK6磷酸化TaSGT1促进小麦对Pst的抗性
利用酵母双杂交实验、荧火素酶互补实验及免疫共沉淀实验表明TaMAPK6能与TaSGT1互作，TaMKK2、TaMAPK4不能与TaSGT1互作。体外磷酸化实验表明TaMAPK6磷酸化TaSGT1，S290和S365是TaSGT1的关键磷酸化位点，突变后不能被TaMAPK6磷酸化。TaSGT1-OE转基因株系接种条锈菌CYR32后孢子堆数量减少，活性氧面积和细胞坏死面积显著增加，增强对条锈病抗性；TaSGT1-KO小麦接种CYR23后，产生了少量夏孢子，条锈菌的生物量与侵染面积显著增加。TaSGT1-KO转基因株系中瞬时表达TaSGT1S290AS365A（磷酸化失活）和TaSGT1S290DS365D（磷酸化激活），发现TaSGT1S290AS365A表达的TaSGT1-KO植株接种CYR23产生少量夏孢子，而TaSGT1S290DS365D瞬时表达则产生明显过敏性坏死，防卫相关基因表达升高，表明TaSGT1模拟磷酸化增强了小麦对条锈菌的抗性。
5.TaSGT1的磷酸化增强核定位促进植物免疫
GFP-TaSGT1定位于细胞质和细胞核中，GFP-TaSGT1S290AS365A定位于细胞质和核膜，GFP-TaSGT1S290DS365D定位于细胞质和细胞核但其细胞核中的荧光信号较强。Western blot结果表明：与GFP-TaSGT1相比，GFP-TaSGT1S290AS365A在细胞质中的蛋白含量更高，GFP-TaSGT1S290DS365D在细胞核中的蛋白含量更高。TaSGT1-OE小麦接种CYR23后细胞核TaSGT1量较未接菌植株增加。在TaSGT1-OE小麦中瞬时表达HASP215则降低细胞核中TaSGT1蛋白水平，削弱小麦抗性。在TaSGT1-KO小麦中瞬时表达含有核定位信号的TaSGT1，产生过敏性坏死，瞬时表达含有核输出信号的TaSGT1的TaSGT1-KO植株，抗病性有所增强，但仍有少量夏孢子堆产生。因此TaSGT1细胞核定位增强小麦对条锈病抗性。
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（转自：小麦研究联盟）
